ICS 11.220 B41 DB64 宁夏回族自治区地方标准 DB64/T1599—2019 TagMGB探针实时荧光定量PCR检测牛鹦鹉 热嗜衣原体方法 地方标准信息服务平台 2019 - 02 -12 发布 2019-05-12实施 发布 宁夏回族自治区市场监督管理厅 地方标准信息服务平台 DB64/T15992019 前 言 本标准的编写格式符合GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求。 本标准由宁夏农林科学院提出。 本标准由宁夏回族自治区农业农村厅归口。 本标准由宁夏农林科学院动物科学研究所起草。 本标准主要起草人：梁小军、王建东、马吉锋、康晓冬、高海慧、于洋、李昕、杨炜迪、岳彩娟、 王晓薇、马乐天、何志军、宋学功、詹信忠、王琼、吴兰慧。 地方标准信息服务平台 I 地方标准信息服务平台 DB64/T1599—2019 TaqManMGB探针实时荧光定量PCR检测 牛鹦鹉热嗜衣原体方法 1范围 本标准规定了利用TaqManMGB探针实时荧光定量PCR检测牛鹦鹉热嗜衣原体的术语、定义、方法。 本标准适用牛鹦鹉热嗜衣原体的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 TaqManMGB探针 TaqManMGB荧光探针是一种寡核苷酸探针，即可进行基因定量分析，又可分析基因突变。 3. 2 实时荧光定量PCR 通过实时监测PCR反应中的荧光信号强度，实现对起始模板定量分析的一种技术。 标准信息服务平台 4测定方法 4.1试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水为无菌双蒸水。 4.1.1 引物：5'-GGCACCATGTGGGAAGGTGCTTG-3" 5'-GTCATTTGGAGAGGATCCTGTG-3" 4.1.2 Taq-MGB探针：FAM-5'-GCGCAGGATACTACGGAGATTATG-NFQ-MGB-3”。 4.1.3 TaqDNA聚合酶。 4.1.4 dNTP：dATP、dTTP、dCTP、dGTP。 1 DB64/T1599—2019 4.1.5DNA提取试剂：0.1%Chelex100水溶液。 4.1.610XPCR缓冲液：200mmol/LTris-HCL（PH8.4），200mmol1/Lkcl，15mmol/LMgcl2。 4.1.7阳性株鹦鹉热衣原体SX5株（牛源）。 4.2仪器和设备 4.2.1IQ5（RD）荧光定量PCR仪。 4.2.2高速离心机：20000r/min。 4.2.3移液器：2.5μL、20μL、200μL、1000μL。 4.2.4水浴锅。 4.3检验步骤 4.3.1试验准备 直接用相应病料进行扩增，如有必要再进行细胞接种。 4.3.2细胞接种 将冻存的样品常温解冻后接种到培养状态良好的Hela细胞中，置于含有5%的有效CO2浓度的二氧化 碳培养箱中，37℃培养48～72h，最后收集细胞。 4.3.3模板DNA准备 将收集的细胞利用UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提法进行提取细菌基因，将提取后DNA置-70℃保 存备用。 4.3.4荧光PCR检测 4.3.2.1反应总体系为20μL，其中含：PremixExTaqM(ProbeqPCR）10.0μL；PCRForward Primer(10 uM) 0.8 μL;PCR Reverse Primer(10 uM) 0.8 μL;Probel.0μL;总DNA2.0 μL;ddH20 5.4μL；反应条件：为95℃预变性30s；95℃5s，62℃20s，72℃20s，40个循环；最后37℃降温20min 至反应结束。 4.3.2.2检测过程中分别设阳性对照、阴性对照。阳性标准菌株鹦鹉热嗜衣原体SX5株（牛源）作为 阳性对照，无菌水作为阴性对照。 4.4结果与报告 4.4.1试验结果成立条件：阳性对照Ct值小于20.0，且有明显的扩增曲线；阴性对照无Ct值，且无 信息服务平台 扩增曲线时，试验结果成立。 4.4.2在4.4.1的基础上判定结果见表1。 2 DB64/T1599—2019 表1 结果判定表 Ct值 扩增曲线 结果 小于等于40.0 明显 牛鹦鹉热嗜衣原体阳性 大于40.0且小于45.0，重复一次 明显的对数增长期 牛鹦鹉热嗜衣原体阳性 大于45.0 又或者无 阴性 其它 样品检测无明显扩增曲线时 牛鹦鹉热嗜衣原体未检出 4.4.3检出限：本标准能够检出阳性鹦鹉热嗜衣原体10fg以上的总DNA。 5废弃物处理和防止污染的措施 收集检测过程中的废弃物，经121℃高压处理。 地方标准信息服务平台 3